华西口腔医学杂志 ›› 2015, Vol. 33 ›› Issue (6): 607-612.doi: 10.7518/hxkq.2015.06.012
邱伟,程兴群,周学东,李雨庆
Qiu Wei, Cheng Xingqun, Zhou Xuedong, Li Yuqing
摘要: 目的 克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)中负责c-di-AMP代谢的相关基因,并使其在大肠杆菌中正确表达及高效纯化。方法 通过聚合酶链反应(PCR)克隆牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的pgn0523、pgn1187和pgn2003三个基因,经过酶切后将目的基因片段与大肠杆菌表达质粒pET28a连接,分别构建出重组表达质粒pETpgn0523 pETpgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003。将重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和鉴定。用镍离子金属亲和层析法对重组蛋白进行分离纯化,BCA法检测目的蛋白的浓度。结果 目的基因pgn0523、pgn1187和pgn2003扩增产物条带与预期大小一致。重组表达质粒pET-pgn0523、pET-pgn1187和pET-pgn2003及其PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证与预期大小相符,测序结果与GenBank中牙龈卟啉单胞菌ATCC33277国际标准菌株的基因序列100%一致。IPTG诱导后的菌体经SDS-PAGE检测得到3个大小分别为19.5×103、39.9×103、66.0×103的蛋白质增强条带,与预期大小相符。镍离子金属亲和层析柱纯化得到的蛋白与预期目的蛋白分子量一致,BCA法测定目的蛋白的浓度分别为0.708、0.523和0.861 mg·mL-1。结论 本研究成功克隆并表达纯化了牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP代谢相关蛋白,得到了较高浓度和纯度的目的蛋白,为进一步探究牙龈卟啉单胞菌c-di-AMP的生理功能及体内代谢途径奠定了基础。
中图分类号: