华西口腔医学杂志 ›› 2017, Vol. 35 ›› Issue (2): 198-202.doi: 10.7518/hxkq.2017.02.017

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尼古丁调控人牙周膜细胞自噬水平的实验研究

杜样1(), 袁帅1, 周志斐1, 邬礼政2, 汪璐璐1, 吴兴安3, 王小竞1()   

  1. 1.军事口腔医学国家重点实验室,国家口腔疾病临床医学研究中心,陕西省口腔疾病临床医学研究中心,第四军医大学口腔医院儿童口腔科,西安 710032
    2.武警后勤学院附属医院口腔科,天津 300300
    3.第四军医大学微生物学教研室,西安 710032
  • 收稿日期:2016-11-05 修回日期:2017-01-02 出版日期:2017-04-01 发布日期:2017-04-01
  • 作者简介:

    杜样,硕士,E-mail:duyangzizi@126.com

  • 基金资助:
    国家自然科学基金面上项目(81470743,81670988)

A preliminary study on the autophagy level of human periodontal ligament cells regulated by nicotine

Yang Du1(), Shuai Yuan1, Zhifei Zhou1, Lizheng Wu2, Lulu Wang1, Xing’an Wu3, Xiaojing Wang1()   

  1. 1. State Key Laboratory of Military Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shanxi Clinical Research Center for Oral Diseases, Dept. of Pediatric Dentistry, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China
    2. Dept. of Stomatology, Affiliated Hospital of Logistics University of People’s Armed Police Force, Tianjin 300300, China
    3. Dept. of Microbiology, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China
  • Received:2016-11-05 Revised:2017-01-02 Online:2017-04-01 Published:2017-04-01
  • Supported by:
    The General Program of National Nature Science Foundation of China (81470743)

摘要:

目的 探讨尼古丁对人牙周膜细胞(hPDLCs)自噬水平的影响。方法 选取因正畸治疗而拔除的前磨牙,采用组织块法分离培养hPDLCs。通过Western blot法筛选尼古丁影响hPDLCs自噬的最佳作用时间及浓度,使用透射电子显微镜(TEM)和免疫荧光染色法检测该作用时间及浓度下hPDLCs自噬体形成情况和自噬标志蛋白LC3的表达情况。结果 LC3Ⅱ蛋白表达在尼古丁作用的12 h内持续升高,从而确定12 h为最佳作用时间;LC3Ⅱ蛋白表达上调具有尼古丁浓度依赖性,1×10-5 mol·L-1为尼古丁最佳作用浓度。TEM和免疫荧光染色证实尼古丁在此浓度及作用时间下hPDLCs细胞质内自噬体的数量增加,自噬标志蛋白LC3表达升高。结论 在一定条件下,尼古丁能够上调hPDLCs自噬水平,为进一步研究细胞自噬与吸烟相关牙周炎的关系奠定了基础。

关键词: 人牙周膜细胞, 尼古丁, 自噬

Abstract:

Objective To explore the effect of nicotine on the autophagy level of human periodontal ligament cells (hPDLCs). Methods Periodontal tissues collected from premolars for orthodontic treatment reasons were used to culture hPDLCs. Western blot analysis was performed to test the most optimal time and concentration of nicotine on the autophagy level of the hPDLCs. Transmission electron microscope and immunofluorescence observation were carried out to detect the form of autophagosomes and expression of autophagy related protein LC3 in hPDLCs under this optimal condition. Results Protein expression of LC3Ⅱ was up regulated with the 12 h nicotine stimulating. Besides that, the up regulation of the protein expression of LC3Ⅱ was concentration dependent and nicotine with a concentration of 1×10-5 mol·L-1 was the most optimal condition. Transmis-sion electron microscope and immunofluorescence observations indicated that nicotine would activate the autophagy level of hPDLCs by increasing the number of autophagosomes and up regulating the expression of autophagy related protein LC3. Conclusion Nicotine could increase autophagy level of hPDLCs, thus affecting the occurrence and development of smoking related periodontitis.

Key words: human periodontal ligament cells, nicotine, autophagy

中图分类号: 

  • R780.2

图 1

培养的hPDLCs细胞形态 光学显微镜 × 100左:第0代hPDLCs; 右:第4代hPDLCs。"

图 2

Western blot检测尼古丁诱导hPDLCs中LC3Ⅱ蛋白的表达情况上:Western blot检测结果;下: LC3Ⅱ蛋白的相对表达量;左:1×10-5 mol·L-1尼古丁作用不同时间;右:不同浓度尼古丁作用12 h。"

图 3

对照组和实验组hPDLCs的细胞质内细胞器和自噬体的数量及形态结构 TEM A:对照组细胞器的形态结构,× 8 000;B:A图的局部放大,可见自噬体形成,× 40 000;C:1×10-5 mol·L-1尼古丁作用12 h后,实验组细胞内细胞器及自噬体的形成,× 8 000;D:C图的局部放大,可见自噬体数量明显增加,× 40 000;红色箭头:自噬体。"

图 4

尼古丁作用后hPDLCs内LC3蛋白的表达变化 荧光显微镜 × 400上:对照组;下:实验组;左:LC3;中:DAPI染色;右:LC3+DAPI染色叠加;红色箭头:LC3。"

[1] Wyganowska-Swiatkowska M, Nohawica MM.Effect of tobacco smoking on human gingival and periodontal fibro-blasts. A systematic review of literature[J]. Prz Lek, 2015, 72(3):158-160.
[2] Chatzopoulos G.Smoking, smokeless tobacco, and alcohol consumption as contributing factors to periodontal disease[J]. Northwest Dent, 2016, 95(1):37-41.
[3] Zhou Z, Li B, Dong Z, et al.Nicotine deteriorates the osteo-genic differentiation of periodontal ligament stem cells through α7 nicotinic acetylcholine receptor regulating Wnt pathway[J]. PLoS ONE, 2013, 8(12):e83102.
[4] Wu L, Zhou Y, Zhou Z, et al.Nicotine induces the produc-tion of IL-1β and IL-8 via the α7 nAChR/NF-κB pathway in human periodontal ligament cells: an in vitro study[J]. Cell Physiol Biochem, 2014, 34(2):423-431.
[5] Yang Z, Goronzy JJ, Weyand CM.Autophagy in autoimmune disease[J]. J Mol Med, 2015, 93(7):707-717.
[6] Wu Y, Zhang Y, Wang L, et al.The role of autophagy in kidney inflammatory injury via the NF-κB route induced by LPS[J]. Int J Med Sci, 2015, 12(8):655-667.
[7] Hung SY, Huang WP, Liou HC, et al.Autophagy protects neuron from Abeta-induced cytotoxicity[J]. Autophagy, 2009, 5(4):502-510.
[8] Duerrschmidt N, Hagen A, Gaertner C, et al.Nicotine effects on human endothelial intercellular communication via α4β2 and α3β2 nicotinic acetylcholine receptor subtypes[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2012, 385(6):621-632.
[9] Bullon P, Cordero MD, Quiles JL, et al.Autophagy in perio-dontitis patients and gingival fibroblasts: unraveling the link between chronic diseases and inflammation[J]. BMC Med, 2012, 10:122.
[10] Suzuki H, Osawa T, Fujioka Y, et al.Structural biology of the core autophagy machinery[J]. Curr Opin Struct Biol, 2016, 43:10-17.
[11] Tanida I, Ueno T, Kominami E.LC3 conjugation system in mammalian autophagy[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(12):2503-2518.
[12] Hao Y, Lu Q, Yang G, et al.Lin28a protects against postin-farction myocardial remodeling and dysfunction through Sirt1 activation and autophagy enhancement[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 479(4):833-840.
[13] Lu J, Sun D, Gao S, et al.Cyclovirobuxine D induces auto-phagy-associated cell death via the Akt/mTOR pathway in MCF-7 human breast cancer cells[J]. J Pharmacol Sci, 2014, 125(1):74-82.
[14] Kim SY, Kang KL, Lee JC, et al.Nicotinic acetylcholine receptor α7 and β4 subunits contribute nicotine-induced apoptosis in periodontal ligament stem cells[J]. Mol Cells, 2012, 33(4):343-350.
[15] Wang XJ, Liu YF, Wang QY, et al.Functional expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors in human perio-dontal ligament fibroblasts and rat periodontal tissues[J]. Cell Tissue Res, 2010, 340(2):347-355.
[16] Liu YF, Wu LA, Wang J, et al.Micro-computerized tomo-graphy analysis of alveolar bone loss in ligature- and nicotine-induced experimental periodontitis in rats[J]. J Periodont Res, 2010, 45(6):714-719.
[17] Song ZC, Zhou W, Shu R, et al.Hypoxia induces apoptosis and autophagic cell death in human periodontal ligament cells through HIF-1α pathway[J]. Cell Prolif, 2012, 45(3):239-248.
[18] An Y, Liu W, Xue P, et al.Increased autophagy is required to protect periodontal ligament stem cells from apoptosis in inflammatory microenvironment[J]. J Clin Periodontol, 2016, 43(7):618-625.
[19] Kim MS, Yun JW, Park JH, et al.Autophagy has a beneficial role in relieving cigarette smoke-induced apoptotic death in human gingival fibroblasts[J]. Int J Med Sci, 2016, 13(5):357-364.
[1] 赵妍, 于阳, 寇育荣. 牙龈卟啉单胞菌调控细胞自噬的分子机制研究进展[J]. 华西口腔医学杂志, 2017, 35(6): 654-658.
[2] 闫娈, 杨德琴. 尼古丁通过调控Toll样受体4抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 华西口腔医学杂志, 2017, 35(4): 368-372.
[3] 杨小军, 谭咏梅, 田智慧, 周婷, 赵望泓, 侯晋. 细菌感染影响牙周组织细胞表达环鸟苷-腺苷合成酶的实验研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2017, 35(2): 203-207.
[4] 安洋, 张慧宇, 郭俊峰, 李鑫, 杨阳, 张纲, 谭颖徽. 降钙素基因相关肽对血清饥饿作用下MC3T3-E1成骨细胞凋亡和自噬的影响[J]. 华西口腔医学杂志, 2017, 35(2): 133-138.
[5] 马玥 任嫒姝 付钢. 丹酚酸B对人牙周膜细胞成骨分化的影响[J]. 华西口腔医学杂志, 2016, 34(5): 468-473.
[6] 陈占伟 孙杜斌 黄圣运 吴海威 张东升. 涎腺腺样囊性癌中BNIP3蛋白的表达及临床意义分析[J]. 华西口腔医学杂志, 2016, 34(4): 404-407.
[7] 史善伟 李一. 自噬及其与肿瘤生长、侵袭、治疗的关系[J]. 华西口腔医学杂志, 2015, 33(1): 98-103.
[8] 詹雪灵 高杰 刘影 胡娇 薛延香 吴补领. 乳铁蛋白下调脂多糖激发的人牙周膜细胞Toll样受体4表达的研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2014, 32(2): 166-170.
[9] 赵海霞 马肃 陈力 刘培红 徐晶 侯琳 陈蕊 秦春林. 尼古丁对大鼠不同部位骨钙磷含量和碱性磷酸酶活性的差异影响[J]. 华西口腔医学杂志, 2013, 31(3): 225-227.
[10] 赵艳红 李洪发 王春玲 杨强 郑朝 付雅丽. Osterix过表达对人牙周膜细胞骨向分化的影响[J]. 华西口腔医学杂志, 2013, 31(2): 199-204.
[11] 徐婧秋 吴丽萍. 脂多糖和白细胞介素-1β对人牙周膜细胞中诱导型一氧化氮合酶表达的影响[J]. 华西口腔医学杂志, 2011, 29(04): 415-419.
[12] 李彦 牛忠英 汤楚华 包博 师天鹏 司少艳. 三维培养模型中胰岛素样生长因子-Ⅰ对人牙周膜细胞增殖及碱性磷酸酶活性的影响[J]. 华西口腔医学杂志, 2011, 29(03): 229-232.
[13] 李斌龙 谢晓莉 彭解英 罗小良 靳路远. 大蒜素对尼古丁致人牙周膜成纤维细胞氧化毒性的保护作用[J]. 华西口腔医学杂志, 2011, 29(01): 9-12.
[14] 赵艳红 李洪发 王春玲 郑朝 付雅丽 魏福兰. 机械力作用下人牙周膜细胞Osterix mRNA和蛋白的表达[J]. 华西口腔医学杂志, 2010, 28(02): 214-218.
[15] 刘娟 赵红宇 轩东英 谢宝仪 章锦才. 人牙周膜细胞群多向分化潜能的实验研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2010, 28(02): 185-189.
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[1] 许天民. 正畸支抗之“惑”[J]. 华西口腔医学杂志, 2012, 30(3): 225 -228 .
[2] 姚超 卜令学 王科 李宁毅 王玲玲 于跃远. 应用细胞片层技术构建组织工程骨修复犬下颌骨缺损的实验研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2012, 30(3): 229 -233 .
[3] 李水根 姚江武. 色素与唾液相互作用的吸附动力学研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2012, 30(3): 239 -242 .
[4] 许卫星 苏俭生. 3种金属烤瓷冠修复后龈沟液中白细胞介素-8水平动态测定[J]. 华西口腔医学杂志, 2012, 30(3): 255 -258 .
[5] 廖锐 孙苗根 顾亚军 王仁飞 刘敏. 锥形束CT在颌骨囊肿诊治中的临床应用[J]. 华西口腔医学杂志, 2012, 30(3): 262 -266 .
[6] 项陈洋 李春洁 董稳航 张凌琳 史宗道 李伟. 牙本质过敏症临床随机对照试验的报告质量评价[J]. 华西口腔医学杂志, 2012, 30(3): 267 -270 .
[7] 马林 景泉 万阔. 口服咪达唑仑治疗牙科恐惧症儿童的临床疗效观察[J]. 华西口腔医学杂志, 2012, 30(3): 271 -274 .
[8] 孙留振 范向飞 肖丹娜 高辉. 骨性Ⅲ类错牙合患者牙弓形态特征分析[J]. 华西口腔医学杂志, 2012, 30(3): 275 -277 .
[9] 孟耀 刘进 郭鑫 邓凯雄 刘曼 周佳. 骨种植钉前牵引对骨性Ⅲ类错患者软硬组织侧貌的影响[J]. 华西口腔医学杂志, 2012, 30(3): 278 -282 .
[10] 曾素娟 胡雁 王小燕 蔡小灵 王莉萍. 广东青少年上颌第一前磨牙根管弯曲情况的研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2012, 30(3): 287 -291 .